NATURE丨基于Cas13的多重核酸检测技术

作者：马倩

2020年4月29日，美国麻省理工学院和哈佛大学Paul C. Blainey和Cameron Myhrvold研究团队在Nature上发表一项新成果。他们研发了使用Cas13进行多重核酸检测的技术，建立了一个核酸检验平台CARMEN (Combinatorial Arrayed Reactions for Multiplexed Evaluation of Nucleic acids)，可以对包括新型冠状病毒在内的多种病原体进行大规模的检验。

绝大多数全球传播的病原体未被发现，破坏了患者的护理并阻碍了疾病爆发的准备和响应。为了实现常规监视和全面的诊断应用，需要一种检测技术，该技术可以扩展以测试许多样品，同时测试许多病原体。该研究团队开发了用于核酸评估（CARMEN）的组合阵列反应，可扩展，多重病原体检测的平台。在CARMEN平台中，含有微孔阵列的基于CRISPR的核酸检测试剂的纳升液滴会自组织，以与扩增样品的液滴配对，从而针对每个CRISPR RNA（crRNA）重复测试每个样品。CARMEN和Cas13检测（CARMEN-Cas13）的组合可在单个阵列上对超过4,500个crRNA-靶标对进行强大的测试。

使用CARMEN-Cas13，作者开发了一种多重分析方法，该方法可同时区分所有169种具有≥10个已公开基因组序列的人类相关病毒，并快速整合其他crRNA以检测2020 COVID-19大流行的病原体。CARMEN-Cas13进一步实现了对A型流感病毒株的全面亚型化，并能多重鉴定数十种HIV替代性突变。CARMEN固有的多路替代和通量功能使其可扩展规模；小型化的检测方法可为每次测试的试剂成本降低300倍以上。基于CRISPR的可扩展，高度重叠的核酸检测将诊断和监测工作从针对高优先级样品的测试转移到对大型样品集的全面检测，这极大地有利于患者和公共健康。

作者开发了一种微孔阵列系统，该系统可利用小型化和自组织进行全面的组合实验。在该系统中，用户准备了一系列液滴乳剂作为输入，输入液滴在阵列的孔中组织起来，无需额外的用户操作或积极的仪器操作就可以重复创建所有可能的成对组合。设想基于CRISPR的核酸检测可以与微孔阵列系统集成，以并行测试许多扩增样品的许多分析物。为了实现高度多元化的核酸检测，作者开发了CARMEN（图1b）。CARMEN–Cas13的输入是已通过PCR或重组酶聚合酶扩增（RPA）和Cas13检测混合物扩增的样品，其中包含Cas13，序列特异性CRISPR RNA（crRNA）和裂解报告基因。每个扩增的样品或检测混合物均在常规的微量滴定板中制备，并与基于溶液的独特荧光色代码结合，用作光学识别器。将每种颜色编码的溶液在氟油中乳化，以产生1-nl小滴。一旦乳化，从所有样品和检测混合物的液滴汇集成一个单一的管和在一个移液步骤-被加载到由聚二甲基硅氧烷（PDMS）模制微孔阵列芯片（图1b）。阵列中的每个微孔随机容纳来自池的两个液滴，从而自发形成液滴输入的所有成对组合，并且将阵列密封在玻璃基板上以物理隔离每个微孔。通过使用荧光显微镜识别液滴的颜色代码来确定每个微孔的含量。暴露在电场中会合并限制在每个微孔中的液滴对，并同时启动所有检测反应（图1b）。CARMEN–Cas13具有敏感性，特异性和统计学上的稳健性。CARMEN-Cas13检测寨卡序列可以实现attomolar灵敏度。此外，CARMEN–Cas13还受益于SHERLOCK的特异性。通过Cas13–crRNA结合和识别可实现序列特异性鉴定，从而避免了其他核酸检测方法中常见的脱靶扩增问题。每个CARMEN–Cas13测定法将M个样品和N个 crRNA 结合起来进行M×N测试，每个测试包括一组crRNA –样品液滴对重复。液滴级的CARMEN–Cas13反应具有高度可重复性，每个标准容量芯片可进行1,000次测试。

 

图1：CARMEN–Cas13达到了attomolar灵敏度。

数百微生物病原体多个样本的准确的测试需要比由现有的复用检测系统提供更高的吞吐量。为了能够以高样品通量进行高度多重检测，作者使用了4种市售小分子荧光团的比例，开发了一套1,050种基于溶液的色标。使用1,050个颜色代码，在保留94％的液滴的允许过滤后，可以正确分类99.5％的液滴。

作者设计了一种CARMEN–Cas13测定法，以针对所有169种人类相关病毒（HVs）进行选择性和同时测试，这些样本具有至少10个可用的已发布基因组（截至2018年10月24日）。使用ADAPT搜索一组最佳的crRNA，这些crRNA对组中的序列敏感，并且对其他组中的序列不敏感。作者使用ADAPT为每个物种设计了一小套crRNA序列，因此，考虑到NCBI GenBank上的基因组多样性，每个crRNA集都可在其目标物种内提供较高的覆盖率（检测到的序列超过90％），并对其他物种具有高选择性。

利用CARMEN–Cas13的强大多路复用功能，作者测试了整个HV面板并演示了其性能。作者通过计算从设计中的每个物种中选择了最佳的crRNA（共169种），并针对每种物种针对合成共有序列进行了评估，每种序列均已使用其相应的引物库进行了扩增（184种PCR产物，包括对照；图2b），针对8个mChips总共进行了30,912次测试。进行了两轮测试，第二轮改进了11种（6.5％）的设计。对于未改变的设计，在两轮之间观察到97.2％的一致性，这表明可以在不改变其余测定性能的情况下提高单个crRNA的水平。在第二轮中，有167个crRNA中的157个（94％）对信号具有阈值以上（背景高6×sd）的靶标具有选择性，所有167个crRNA的曲线下面积（AUC）为0.997。此外，即使使用所有引物库扩增了合成靶标，也未观察到广泛的交叉反应性。

由于在稿件审阅过程中爆发了COVID-19，作者迅速将针对新型冠状病毒SARS-CoV-2 的新测试27纳入了从HV面板中获取的冠状病毒面板中，从而证明了该模块化主机的强大功能适应现实世界中的挑战（图2d）。使用单个芯片，可以针对冠状病毒面板并行测试400多个样本。

为了在更具挑战性的情况下测试CARMEN，作者对HV面板针对58种血浆，血清，喉咙和鼻拭子样本进行了评估，这些样本来自各种确诊感染的患者。每个临床样品均视为未知样品，并使用所有15个引物库进行扩增（图2e）。为了提高测试通量，随后将PCR产物分为三组（每个患者样品五个“ metapools”），并用HV组的crRNA进行测试。作为金标准的比较读数，每个样品进行了超过200万次读取的下一代测序（NGS）。在这两种方法均可解释的11,268项测试中，有11,236项（99.7％）是一致的（图2f）。作者发现CARMEN在大多数样本中识别出已知的感染，在这些样本中NGS从这些病毒中检测到任何序列，包括CARMEN与NGS在登革热和Zika试验中完全一致（图2g）。还可以根据CARMEN和NGS检测到CARMEN crRNA靶向序列的能力进行比较，这表明在测试的crRNA靶标中，CARMEN比每个位点都比NGS敏感（图2h）。值得注意的是，靶基因座处的序列异质性是所有靶向核酸检测方法都面临的挑战，CARMEN可以通过crRNA复用技术克服这一挑战。最后，在对患者样本进行测试期间，CARMEN和NGS均识别出样本中先前不存在的特定病毒（图2i）。因此，尽管很明显，HV面板可用于并行监视许多病毒，但重要的是要认识到，将HV面板的结果与患者症状和医学专业知识相结合对于在临床上有效使用CARMEN测试至关重要。

 

 

图2：使用CARMEN–Cas13对HV进行综合鉴定。

利用Cas13检测的特异性，作者使用CARMEN–Cas13来并行区分所有流行病学相关的甲型流感血清型。甲型流感等病毒物种内的多样性给检测带来了巨大挑战。分析必须正确识别一组菌株中的许多不同序列，同时保持对该组的选择性。为了区分甲型流感病毒的血凝素（H）和神经氨酸酶（N）亚型H1-H16和N1-N9，作者设计了H和N扩增子，这些扩增子足够保守，可以用两个平行引物对进行扩增，并使用ADAPT设计特定的crRNA识别亚型（图3a）。作者使用H1-H16和N1-N9的合成共有序列测试了每组的最佳crRNA，并成功鉴定了这些亚型（图3b，c）。作者用合成的序列进一步测试了N-亚型，这些序列共同覆盖了亚型N1-N9内超过90％的序列多样性，并从35个序列中鉴定出32个（91.4％）（扩展数据图8c）。最后，作者使用了20种在2018-2019年流感季节期间感染的人的咽喉和鼻拭子对选择的亚型分析进行了验证，并且能够成功地将所有这些感染亚型化，显示各中心进行的定量PCR逆转录结果与实验室结果100％。这些结果证明该检测方法可能潜在地鉴定出144种H1-H16和N1-N9亚型的可能组合。

 

图3：使用CARMEN-Cas13区分流感亚型。

Cas13的出色特异性还使CARMEN–Cas13能够鉴定多重感染中与临床相关的病毒突变，例如那些赋予耐药性的突变。为了证明这一点，作者设计了引物对平铺HIV逆转录酶编码序列和一组crRNAs以识别6抗药性突变（图4a），其是普遍的抗病毒初治患者群体。测试针对合成靶标的设计，可以并行识别所有六个突变（图4b）。对22例HIV感染者的样本进行了逆转录酶DRM分析验证，其中一些样本包含多个突变，并证明与样本提供者的Sanger测序结果相符90％，与CARMEN测试同时进行的NGS相符86％。为了证明该方法的通用性，作者开发了一个CARMEN面板来测试21种与临床相关的DRM的HIV整合酶，并在一组9种复合合成靶标中鉴定了所有这些突变（图4e）。

 

图4：使用CARMEN–Cas13进行多路DRM识别。

作者已经证明CARMEN–Cas13在区分物种，品系和单核苷酸多态性（SNP）级别的病毒序列方面具有广泛的用途，并具有快速开发和验证高度多重检测板的能力。更普遍的是，CARMEN–Cas13通过提高通量，减少每次测试的试剂和样品消耗量以及在更宽的动态范围内进行检测，增强了基于CRISPR的核酸检测技术。正如作者针对SARS-CoV-2所展示的，CARMEN的灵活性和高通量可以适应现有CARMEN测定法中新扩增引物或crRNA的添加和快速优化，从而有助于检测新发现的病原体序列。此外，在更广泛的病原体检测，发现和进化方面，CARMEN和NGS相互补充。CARMEN可以快速识别受感染的样品，以进行进一步的测序以跟踪病毒的持续进化，新识别的序列可以为基于CRISPR的诊断方法的改进提供参考。将来，我们可以想象要部署针对特定地区和疾病爆发的检测小组，以测试来自选定种群的数千个样本，包括动物载体，动物水库或出现症状的患者。在临床护理中采用这样的小组将需要专家对结果进行仔细的语境解释。CARMEN可以大规模进行基于CRISPR的诊断，这是迈向常规，全面疾病监测以改善患者护理和公共卫生的关键一步。

Ackerman， C.M.， Myhrvold， C.， Thakku， S.G. et al. Massively multiplexed nucleic acid detection using Cas13. Nature (2020). https：//doi.org/10.1038/s41586-020-2279-8