Nucleic. Acids Res. 丨基因编码的带有Pepper的RNA传感器
今天为大家分享一篇2023年7月发表在Nucleic Acids Research的 题为“Genetically encoded RNA-based sensors with Pepper fluorogenic aptamer（基因编码的带有Pepper的RNA传感器）”的文章，通讯作者是中科院北京生科院的李幸教授，主要研究方向为研发荧光RNA适配体及其靶向小分子探针，实现原位、实时、动态地追踪RNA，解析体内RNA的时空信息和功能；开发基于CRISPR的染色体高分辨追踪技术，研究染色体有丝分裂、转录、自修复、易位、基因编辑等功能；针对具备重要科学意义的RNA，致力于研发小分子探针、靶向降解剂、调控剂等。
研究背景
细胞是代谢与功能的基本单位，要了解细胞内的代谢活动以及代谢物在细胞过程中的作用，需监测活细胞内小分子的动态和通量。常用的监测工具是传统的荧光蛋白传感器，但由于缺乏靶标结合的蛋白结构域和信噪比较低，限制了其应用。新型的RNA荧光传感器克服了这些缺点，被广泛研究应用。
结果与讨论
- 带有Pepper的RNA传感器的设计策略
图 1不含有G4的Pepper中插入点的确定
新兴的RNA荧光传感器在结构上主要分为两类：包含G4结构域的RNA荧光传感器（如Spinach、Broccoli等）和不包含G4结构域RNA荧光传感器（如Pepper等）（图1A）。作者首先揭示了带有G4结构域的RNA荧光传感器的不稳定性，细胞中含有G4解旋酶可以使处于折叠状态G4变为非折叠状态，同时这种状态会被RNA结合蛋白所稳定，导致荧光传感器失去其功能。Pepper RNA荧光适体不含G4结构域，在细胞内荧光信号稳定。G4结构的形成依赖K+而不依赖Li+，作者测试了RNA适体诱导荧光的钾依赖性，Broccoli的荧光表现出K+依赖性，但Pepper没有表现出K+依赖性，这表明Pepper不含G4结构（图1B）。接着作者构建这种不含G4的RNA传感器，包含三个结构域：Pepper、target-binding aptamers、transducer，构建传感器的关键是要把后两部分的结构插入到Pepper的关键茎中，作者通过指数富集（SELEX）过程研究了配体的系统进化（Systematic Evolution of Ligands）和Pepper的晶体结构。SELEX库生成的Pepper包含两个由12个碱基固定序列分隔的26个碱基随机延伸。12碱基固定序列与两个碱基组成了Pepper稳定的茎环结构—茎环1（图1C）。由于茎环1的主要部分是每个文库成员中的固定序列，因此它可能不太可能与HBC荧光团进行序列特异性接触。Pepper的晶体结构支持茎环1不与HBC相互作用。然后，作者假设Pepper中的茎环1在HBC结合中具有结构作用，可以在传感器设计中利用。为了验证这个想法，作者对茎环1结构进行了突变。结果表明，茎环1在Pepper荧光中具有重要的结构作用（图1 D）。因此，作者将茎环1作为插入靶向结合适体的切入点，并设计了各种基于Pepper的小分子和蛋白质传感器。
- 基于Pepper的传感器的体外表征
图 2基于Pepper的高活性、高选择性和高精度的SAM传感器的开发
SAM是一种代谢物，在几乎所有细胞甲基化反应中充当甲基供体，并调节DNA、RNA和蛋白质的活性。作者开发了可以监测细胞内SAM浓度变化的Pepper RNA传感器。蓝色部分是与SAM结合的结构域，红色部分是换能器结构域，绿色部分是Pepper结构域（图2A），通过改变transducer结构域的碱基序列来增强传感器的灵敏度和特异性（图2B），通过实验作者确定了transducer部分的碱基序列，提高了监测SAM传感器的灵敏度，具有最佳transducer序列的SAM传感器的荧光增强了19.3倍，并且具有高选择性（图2C, D）。作者通过将带有Pepper的RNA传感器与带有RG4的RNA传感器进行了检测能力的对比，带有Pepper的RNA传感器监测SAM的浓度范围更大且荧光信号不受高浓度SAM的抑制（图2E）
- 细胞间异质性SAM成像及其生物合成途径
图 3监测个体人类细胞中SAM生物合成途径
甲硫氨酸（Met）是细胞内SAM生物合成的底物，Met可以通过MATase转化为SAM（图3A）。作者进一步验证在缺乏Met的情况下，荧光下降是由于SAM消耗引起的，作者在培养基中加入100 μM的Met，看荧光是否会恢复。通过重新在培养基中加入Met，细胞荧光在4 h后恢复（图3B）。作者发现HEK293T细胞表现出三种SAM合成速率模式。I型细胞的SAM消耗能力较弱，但SAM合成能力较高，8 h时细胞内SAM水平高于初始状态；II型细胞的SAM消耗和合成能力中等；III型细胞SAM水平逐渐升高，最后达到一个平台期（图3 C）。这些数据表明，SAM传感器能够实时检测活细胞中SAM的消耗和生物合成。
- 监测MATase活性和基因表达
图 4实时监测MATase活性和基因表达
首先，作者监测了活的人类细胞中的MATase活性。环亮氨酸能够抑制MATase活性，降低内源性SAM水平（图4A）。作者在表达SAM传感器的HEK293T细胞培养基中加入环亮氨酸（30 mM）。经环亮氨酸处理后，细胞荧光在2小时内降至最低。接着，作者用新鲜的不含环亮氨酸的培养基替换原来的培养基，去除环亮氨酸。去除环亮氨酸后，细胞荧光在3小时内恢复（图4B, C）。这些数据表明，SAM传感器能够实时监测活的单个人类细胞中的MATase活性。
接下来作者验证SAM传感器是否可以监测HeLa癌细胞中MATase基因的表达水平。由于组蛋白乙酰化靠近MATase基因的启动子区域，MATase mRNA在癌细胞中表达水平较低。因此，抑制组蛋白乙酰化可能诱导MATase mRNA的表达，导致SAM积累。作者在HeLa细胞中表达SAM传感器，并用组蛋白乙酰化抑制剂SAHA处理细胞，上调MATase mRNA的表达（图4A）。加入SAHA 8 h后，细胞荧光明显增加（图4D, E）。定量反转录- PCR （RT-qPCR）证实，SAHA处理后MATase mRNA表达升高（图4F）。这些数据表明，SAM传感器可以指示癌细胞中MATase表达的细胞内表观遗传调控。
- 使用比例SAM传感器评估MATase抑制剂的抑制能力
图 5基于Pepper的比例SAM传感器
为了准确地研究MATase活性，作者设计了一个比例SAM传感器。比例传感器的信号与RNA表达水平无关，因此可以定量评估MATase活性。作者选择了另一种非G4荧光RNA适配体RhoBAST作为比例SAM传感器的内部参考。RhoBAST与TMR-DN特异性结合发出的荧光。作者将基于Pepper的SAM传感器和RhoBAST插入到F30支架的两条臂中（图5A）。与SAM孵育后，比例SAM传感器显示绿色荧光明显增加，而红色荧光不受影响（图5B）。这些结果表明，比例SAM传感器的构建成功。
接下来作者将HEK293T细胞与HBC和TMR-DN荧光团孵育后，检测到了基于Pepper的SAM传感器的绿色荧光和RhoBAST的红色荧光。通过计算绿校正荧光强度可以获得比率信号（图5C）。由于RhoBAST荧光不受SAM的影响，因此比值信号的波动可以反映细胞SAM水平和MATase活性的波动。这些数据表明，比例SAM传感器在活细胞中有效地发挥作用。
最后，作者将MATase抑制剂AG-270添加到表达比例SAM传感器或对照RNA的HEK293T细胞中。孵育24 h后，通过测量绿色荧光比的比率信号来评估MATase的活性。随着AG-270浓度的增加，表达比例SAM传感器的细胞中的比例信号显著降低，而对照组则不受AG-270的影响(图5D, E)。比值信号的降低可以反映MATase的抑制率。通过分析不同浓度AG-270的比值信号，作者绘制了剂量—响应曲线，并确定IC50值为约为19.4 nM（图5D），这与之前的报道的相差不大（IC50 = 14 nM）。这些结果表明，比例式SAM传感器可以准确地检测MATase抑制剂在活细胞中的功效。
- 基于Pepper的RNA传感器用于检测其他小分子
图 6基于Pepper的RNA传感器可由不同的小分子激活
为了确定基于Pepper的传感器的通用性，作者将其他靶标结合RNA序列与Pepper结合，并检测其他小分子。作者使用Pepper生成了四环素传感器和鸟嘌呤传感器（图6A, E）。对于四环素和鸟嘌呤传感器，通过改变transducer结构域的碱基序列来增强传感器的灵敏度和特异性，对于四环素传感器来说，具有最佳换能器序列的四环素传感器的荧光增强了83.7倍，且具有很强的特异性（图6B, C）。对于鸟嘌呤传感器来说，具有最佳换能器序列的鸟嘌呤传感器的荧光增强了5.0倍，且具有很强的特异性（图6F, G）。基于Pepper的传感器可以在活细菌细胞中成像四环素或鸟嘌呤（图6D, H）。这些数据表明，基于Pepper的传感器可以应用于药物和其他小分子代谢物。
- 基于Pepper的传感器可以感应金属离子和蛋白质
图 7基于Pepper的监测活细胞离子和蛋白质的RNA传感器的设计
作者设计了一种基于Pepper的Ag+传感器，作者将C-C错配插入Pepper茎环1。在没有Ag+的情况下，C-C错配导致茎环1结构不稳定，导致低荧光。在Ag+存在下，C-Ag+-C金属碱基对形成，稳定茎环1结构，导致荧光增强（图7A）。作者通过调整C-C错配插入的位置和数量来优化Ag+传感器。优化后的传感器设计实现了3.7倍的荧光增强（图7B）。其他金属离子不能在Ag+传感器中诱导荧光(图7C)。这些数据表明，基于Pepper的传感器可以设计用于金属离子检测。作者在HEK293T细胞中表达Ag+传感器。HEK293T+细胞与Ag+孵育1小时后，Ag+依赖性细胞荧光清晰可见（图7D）
接下来，作者构建了可以监测链霉亲和素的RNA传感器，作者将具有不同热力学稳定性的transducer、链霉亲和素结合适体以及Pepper融合（图7E）。作者测试了每种RNA传感器对链霉亲和素的荧光响应性。在加入链霉亲和素后，最优传感器显示出7.2倍的荧光增强，并显示出高选择性（图7F, G）。最后，作者使用基于Pepper的传感器对活细胞中的蛋白质表达水平进行成像（图7H）。这些数据表明，基于Pepper的传感器为构建明亮和稳定的蛋白质传感器提供了一种可推广的方法。
总结
本文作者开发了一种基于Pepper的RNA传感器，设计了具有较高的活性、灵敏度和选择性各种传感器，用于监测体外和活细胞中的代谢物、合成化合物、蛋白质和金属离子的浓度变化。
文献来源：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37486780/
