NUCLEIC ACIDS RES | G-四链体诱导/稳定剂pyridostatin靶向SUB1促进反铂类复合物的细胞毒性
大家好！今天分享的文章来自中科院活体分析化学重点实验室汪福意课题组，汪福意课题组研究方向涉及金属抗肿瘤药物、 高质量分辨原位液相二次离子质谱系统等。
研究背景：
G-四链体(G4)是一种稳定的核酸二级结构，由富G碱基的DNA或RNA序列的氢键形成，在人类染色质中有超过10,000种G4潜在序列。G4主要位于端粒，癌症相关基因的体细胞拷贝数改变（SCNA）区域。G4也广泛分布于高转录的基因，特别是调控区域，如启动子、剪接位点和5’-非翻译区(5’-UTR)。由于KRS、BCL2等致癌基因中有丰富的G4潜在序列，G4也可能作为癌症的生物标志物和潜在的治疗靶点。许多G4稳定剂，如pyridostatin、Phen-DC3和BRACO19，可以触发DNA双链断裂(DSBs)的形成，激活DNA修复途径，这表明G4稳定剂可能用于癌症治疗。
Pyridostatin(PDS)是一种广为人知的G-四链体(G4)诱导/稳定剂，使DNA和RNA聚合酶不能打开G4形成DNA双链断裂。PDS诱导功能性端粒异常，并在特定的基因组靶点产生DNA损伤，表现出抗增殖活性。由于PDS和G4之间的特异性相互作用，PDS也被用作G4富集、测序和生物学功能研究的工具，PDS甚至可以替代某些G4结合蛋白（如转录因子）来干扰基因表达。但是PDS作用的基因和对全基因组表达的影响尚不清楚。
该研究首次证明PDS下调PC4的表达，显著促进反式-[PtCl2（NH3）（噻唑）]（trans-Pttz）复合物对HeLa细胞的细胞毒性。
结果与讨论：
使用Cas9-SunTag技术结合HA-tag免疫染色标记端粒，使用G4抗体标记G4，共聚焦结果显示PDS诱导端粒区G4的形成。更多细胞的统计结果显示，PDS处理后，端粒与G4的共定位比降低，而G4与端粒的共定位比增加，这表明在PDS存在时，在非端粒区域形成了更多的G4。换句话说，PDS主要针对非端粒核酸序列，这与之前的报道一致。
应用蛋白质质谱组学分析PDS（10μM，24h）处理后的Hela细胞，共鉴定出4316种蛋白，其中674种蛋白含量改变有统计学意义。674种蛋白中有637种蛋白的丰度比（AR）介于0.667和1.50，说明大部分蛋白受影响不大。这些蛋白中只有4种蛋白和端粒直接相关，它们的丰度比并无显著变化，这提示PDS对端粒相关蛋白表达的影响很小，这也与之前荧光共定位的结果一致。PDS作用后有22种蛋白显著下调，16种蛋白显著上调，差异表达蛋白主要是DNA/RNA结合蛋白，参与细胞代谢、细胞分化和增殖。
作为一种G4诱导/稳定剂，PDS被普遍认为是通过诱导/稳定DNA和RNA的G4调节基因表达。进一步，研究者发现下调的20个基因中有80%自然形成G4结构，上调的16个基因中有81%（13个）在其启动子区域有G4结构。下调基因的G4潜在序列的平均数量高于上调基因的（表1），但序列数量与表达量减少并不直接成正比。
为了弄清楚PDS是否在转录水平或翻译水平上抑制了其靶基因的表达，进行qPCR。PDS对SUB1（编码PC4）转录水平的影响很小。又检测了两对基因——COL5A1和THRAP3，ARL6IP4和GPC1，分别在转录序列和启动子区域有最多潜在的G4序列。尽管COL5A1的G4数量最多，却未被PDS下调。这再一次说明PDS调节基因表达不单单取决于基因中G4结构的数量。
进一步生信分析发现所有PDS下调的蛋白（FC＜1.0）激活了三个转录因子：FOXO1、MITF和TP63，随后上调了下游蛋白，包括ANLA、KIF11、CCNA2和RRM2。
在PDS下调基因中，编码PC4的SUB1具有第二高的倍数变化（4.76），WB结果也显示PDS几乎沉默了PC4蛋白表达。
内源性PC4是一种丰富的单链DNA结合蛋白，可刺激激活因子依赖的II类基因转录——特异性识别G4结构和DNA损伤，从而通过刺激非互补DNA末端的连接来激活双链断裂(DSB)修复，并促进基因的稳定性。研究者之前曾发现PC4能识别并特异性结合trans- PtTz（一种细胞毒性转铂复合物）交联DNA，在trans-PtTz介导的DNA-细胞损伤发挥重要作用（2014 JACS）。这启发他们研究PDS诱导的PC4下调对trans- PtTz细胞毒性的影响。
首先测量了PDS培养Hela细胞的IC50，显示PDS是一种低细胞毒性化合物（IC50＞100μM）。然后测量在PDS存在的情况下trans- PtTz的细胞毒性，结果显示10μM PDS对trans- PtTz的细胞毒性没有影响。鉴于PDS下调PC4需要时间，在PDS预处理HeLa细胞24h后，对trans- PtTz进行体外抗增殖实验。结果表明，经2μM和10μM PDS预处理后，trans- PtTz的IC50分别显著降低了4.2倍和5.5倍。而PDS预处理后顺铂(cisplatin，使用最广泛的化疗药物之一)的IC50却略有升高。
为了进一步阐明PDS放大的trans-PtTz细胞毒性，使用飞行时间二次离子质谱分析（TOF-SIMS）对Hela细胞中的trans-PtTz成像。结果图像显示，在单细胞水平上以及组间比较， PDS预处理组的[PtCN]-含量高于对照组，证实了PDS预处理增加了trans-PtTz在HeLa细胞中的积累，进而促进了trans-PtTz的细胞毒性，很可能是通过下调PC4表达减少了铂化DNA的修复。此外，ICP-MS对大规模HeLa细胞基因组DNA中Pt含量的测定表明，PDS预处理的HeLa细胞中与DNA结合的铂含量比对照细胞中与DNA结合的铂含量高4倍。
综上所述，本研究首次发现G4稳定/诱导剂PDS显著下调了HeLa细胞中的22个蛋白，同时显著上调了16个与细胞周期和细胞组分组织调控相关的蛋白。PDS被证明可以下调PC4的表达，延缓了PC4介导的DNA损伤修复，增加trans-PtTz在细胞中的积累，从而显著增强该复合物的细胞毒性。这一发现加深了对PDS生物学功能的理解，为设计新的多靶点铂类抗癌药物来对抗顺铂耐药提供了一种新的策略。
Hou Y, Gan T, Fang T, Zhao Y, Luo Q, Liu X, QiL, Zhang Y, Jia F, Han J, Li S, Wang S, Wang F. G-quadruplex inducer/stabilizerpyridostatin targets SUB1 to promote cytotoxicity of a transplatinum complex.Nucleic Acids Res. 2022 Mar 8:gkac151. doi: 10.1093/nar/gkac151. Epub ahead ofprint. PMID: 35258624.
