ANGEW CHEMIE丨DNA功能化囊泡介导的生物反应

作者：徐锐

今天为大家分享一篇发表在“Angewandte Chemie”上的文章，标题为“Barcoding biological reactions with DNA-functionalized vesicles”。文章的通讯作者是西北大学生物过程化学研究所的N.P. Kamat教授。

目标囊泡之间的融合对于在复杂水相环境中选择性地控制囊泡之间的生物学反应具有重要的应用前景。在本篇文章中，作者探索了两种不同特点的囊泡的膜，DNA系带和相分离的膜是怎样促进特定囊泡之间的融合。作者证明了膜的相分离给膜的融合提供了一种驱动力，在DNA介导的融合过程中提高了融合的效率。同时，通过正交实验，DNA系带方法不仅可以实现膜的直接融合，并且成功地将内含物递送到目标囊泡。作者进一步证明了由DNA系带功能化的囊泡还可以引发体外的蛋白表达，完成了一些模式可溶性蛋白和膜蛋白的合成。通过这样一种策略，实现了时间和空间上的无细胞反应的控制，为构建人工细胞系统提供了广阔的思路。

首先，作者探索了囊泡的膜应该具有哪些特点才能够促进囊泡高效的融合。这些特点包括膜的结构域和域边界上的疏水性错配（图1A）。作者考察了具有怎样生物物理特性的膜可以用来控制膜融合的范围。DNA寡聚核苷酸功能化的囊泡的膜具有分子特异性，能够将DNA内含物递送到指定的囊泡中去。

图1. DNA寡聚核苷酸可以控制囊泡的融合。（a）本实验中用到的DNA序列示意图，两组互补的DNA序列（例如 A和A’）可以导致细胞融合。（b）通过使用不同组合的DNA序列，实现了不同囊泡之间的融合的控制，同时完成了生物学反应。例如无细胞蛋白质合成。

为了合成能够进行膜融合的囊泡，作者用DNA修饰的磷脂合成了小尺寸单层脂质体（SUVs）。囊泡的基本组成是三种物质的混合物，包括二油酰磷脂酰胆碱（DOPC），二油酰磷脂酰乙醇胺 （DOPE）和胆固醇（Chol），它们的摩尔比是3：1：1。其中DOPE通过在双层膜中进入负曲率可以促进膜融合，同时胆固醇可以改变膜的结构和物理特性，也会促进膜融合。当囊泡形成之后，胆固醇修饰的DNA链可以插在囊泡表面，实现对囊泡的功能化修饰。通过DNA互补序列的杂交作用，像拉链一样使得带有DNA互补序列的囊泡互相接触。作者用能量共振转移（FRET）的方法证明了具有DNA互补序列的囊泡发生了膜融合（图2）。作者估算信号报告囊泡表面大约有100个DNA序列，而目标囊泡表面大约有50个DNA序列。

接下来，作者探索了哪一种膜的结构域可能促进膜融合。根据最新的模式膜研究和计算结果表明，在脂质体中存在的相分离结构域可以促进由HIV膜融合蛋白介导的融合过程。囊泡膜中相的不均一性和线张力对于病毒的膜融合有非常重要的作用。所以作者猜想，是不是类似的结构域同样会促进由DNA介导的膜融合过程。为了合成这样一种具有相分离结构域的膜，作者在囊泡中插入了二硬脂酰磷脂酰胆碱（DSPC），使得最后囊泡组分比值为2 DSPC:1 DOPC:1 DOPE:1 Chol。因为DSPC虽然和DOPC，DOPE一样具有18个碳的酰基链，但是DSPC是完全饱和的，这就导致了膜中有序液体和无序液体相之间存在磷脂相分离。通过显微镜观察大尺寸单层脂质体 （GUVs），作者确认了含有DSPC磷脂的囊泡的形成（图2 A,B）。当膜的结构域中含有DSPC和cDNA系带时，磷脂混合率从15%上升到27%（图 2C）。有意思的是，这种提高只有在目标和报告囊泡中都含有脂筏时才存在。这样的结果证明融合事件的增加很有可能是由于存在两相的膜的热力学不稳定性。为了确认观察带有DNA介导的囊泡融合可以让内含物也融合，作者用可以发生自淬灭的浓度的钙黄素分别包裹在均相和相分离囊泡中，然后和具有相同膜结构的空的囊泡混合。如果囊泡发生融合了，钙黄素的浓度就会降低，从而使得荧光强度增强。

图2.相分离促进DNA介导的膜融合。GUVs的荧光强度在 DSPC: DOPC: DOPE: Chol摩尔比分别等于（a）0：3：1：1和（b）2：1：1：1和0.1 mol% Rhod-PE（存在于无序液体相中）。（c）总磷脂均相混合（0 DSPC: 3 DOPC: 1 DOPE: 1 Chol）和相分离囊泡（2 DSPC: 1 DOPC: 1 DOPE: 1 Chol）。（d）均相囊泡和相分离囊泡的内含物混合实验。

作者进一步探索了膜结构域中存在导致线张力增加的疏水性错配区是否可以作为一种促进膜融合的策略。作者系统地去改变一种膜相中的酰基链长度而其他相中的磷脂酰基链保持不变（18个碳），当这些磷脂混合的时候观察对于疏水性错配区的影响。第一，作者通过用更短的DMPC（14:0）和更长的24：0 PC来代替 DSPC（18：0）来改变液体有序结构域的厚度（图3 A）。接下来，作者通过用短的14：1 PC 和长的24：1 PC代替DOPC(18: 1)来改变液体无序结构域的高度（图3 B）。在这两种情况下，当磷脂酰基链长度从14个碳增加到24个碳时都观察到了磷脂混合的增加。24个长度的碳氢链产生了更大的结构域。随着结构域的增大，线张力增大，所以导致膜融合的效率提高。另外，更长的磷脂尾巴可能填充到膜融合过程中产生的空隙中去，使得膜更容易弯曲和重构，从而降低能垒。特别地，当只使用不饱和磷脂时，结构域的形成被阻止，但是仍然保留着疏水错配，磷脂的融合效率会降低到和具有均一厚度的均相囊泡同样的水平（图3 C）。所以，以上这些实验证明了，增加相分离结构域的尺寸和结构域边界之间的疏水错配可以极大地提高DNA介导的膜融合效率。

图3.在相分离囊泡中疏水错配控制DNA介导的膜融合。（a）液体有序相（X）改变时的囊泡中总磷脂的混合。（b）液体无序相（X）改变时的囊泡中总磷脂的混合。（C）液体无序磷脂组成的均相囊泡的总磷脂混合。

接下来，作者猜想由DNA介导的膜融合以及相关的囊泡内含物混合是否可以用来在特定的囊泡中引发生物反应。起初，作者研究了DNA系带促进目标囊泡的融合和内含物递送的程度，这对于引发和维持囊泡内的生物化学反应非常重要。第一，通过磷脂混合实验，实现了在同一溶液中四类不同的囊泡何时何地与目标囊泡发生融合。目标SUVs由摩尔比为 3 DOPC: 1 DOPE: 1 Chol的磷脂组成，同时表面被两组不同的DNA功能化（A 和B）。4类由摩尔比为 3 DOPC: 1 DOPE: 1 Chol的磷脂组成的SUVs在两个不同的时间点加入目标SUVs中。通过改变后加入的囊泡表面的DNA序列和加入的时间，实现了对于膜融合的时间和空间的控制（图4 A）。为了能够在显微镜下观察到囊泡中蛋白质的合成，作者用标记了罗丹明或者Cy5.5的摩尔比为2 DSPC:1 DOPC: 1 DOPE: 1 Chol的磷脂组成的GUVs作为接受内含物的目标囊泡。然后合成含有10碱基的荧光标记的DNA链作为要被递送到目标细胞的引发蛋白质合成基因内含物的SUVs。作者观察到了只有表面功能化了互补的DNA序列的囊泡可以与目标囊泡融合（图4 B）。反之则不能融合（图 4C）。

图4.DNA介导的膜融合可以控制特定囊泡的融合和内含物DNA的递送。

最后，作者考察了由DNA介导的囊泡融合可否引发更加复杂的生物反应：无细胞蛋白质合成。为了维持生物组分在反应中的稳定性，囊泡维持在4℃中，因为这个温度低于膜中相分离结构域的相变温度。作者选取了两种模式蛋白作为目标合成蛋白，可溶性蛋白（绿色荧光蛋白，sfGFP）（图 5 A）和膜蛋白（MscL-GFP 图5 B）。作者将可以表达目标蛋白的质粒包裹在一类囊泡中，无细胞表达系统包裹在另外一类囊泡中，将这两类囊泡功能化互补的DNA系带。在37℃下按照1：1的比例混合，成功了观察到了GFP的荧光信号。

图5. DNA介导的膜融合用于无细胞蛋白表达。

综上所述，本文证明了DNA介导的膜融合可以通过改变囊泡的膜组分来提高融合效率。同时，这种融合可以用来递送DNA内含物到目标囊泡。最终，作者完成了在时间和空间上对于无细胞的蛋白质合成的控制实验，为将来构建更加复杂的人工细胞系统提供一种技术策略。