CELL丨新发现：活细胞膜外侧的RNAs糖基化修饰
作者：李好问
多糖作为聚合糖分子可以修饰重要的生物分子，如脂质和蛋白质，调节许多基本的细胞功能。例如胚胎的形成、宿主病原体识别和肿瘤免疫相互作用都依赖于糖基化。那么RNA作为另外一种生物聚合物分子，是所有已知生命的中心。传统的认知中，多糖和RNA就像生活中平行的世界，没有相交，仅仅只有少数基于单糖的tRNA修饰。而当以RNA作为主要研究领域的Flynn和将糖生物学带入主流研究的Carolyn相遇的时候，惊人的发现了一类全新生物分子-位于细胞膜外侧的糖基化RNA。
5月17日，哈佛大学波士顿儿童医学中心医院的助理教授Ryan. Flynn和斯坦福大学的Carolyn. Bertozzi教授在国际顶级期刊-《细胞》（Cell.）上发表研究论文《Small RNAs are modified with N-glycans and displayed on the surface of living cells》，报道了这一爆炸性的发现。
Ac4ManNAz作为一个唾液酸代谢途径的标记分子，主要途径是代谢为唾液酸，进而转化为CMP-唾液酸，然后并入多糖末端，通常被用于细胞膜叠氮位点的显露。作者他们将100 mM Ac4ManNAz在HeLa细胞中孵育48 h后，将细胞中RNA进行提取和纯化，向纯化后的RNA中加入DBCO修饰的生物素（如图1A所示），通过变性凝胶电泳分离，并进行印迹分析（如图1B所示），竟在高分子量区域（>10 kb）观察到生物素化的RNA，且在一定时间范围内随着Ac4ManNAz的孵育时间增加，生物素化的RNA水平也在增加，说明了用Ac4ManNAz处理后的细胞将叠氮的标签标记到RNA上，即多糖RNA-glycoRNA的存在。紧接着，用Turbo DNase对RNA处理后，对glycoRNA没有任何影响，而用RNase Cocktail处理后，glycoRNA消失，若用SUPERaseln先对RNase Cocktail进行抑制，则glycoRNA的印迹产生（如图1C所示）。使用同样的策略，发现在人类H9、K562、GM12878、T-all 4188和小鼠CHO细胞中均检测到glycoRNA。对小鼠进行腹腔注射Ac4ManNAz，获取肝脏和脾脏中的RNA分析同样检测到glycoRNA，且与Ac4ManNAz的剂量成依赖关系（如图1D所示）。此刻已经充分说明glycoRNA的存在，但仍然存在以下疑点：（1）RNA的种类及序列（2）多糖的种类及组成（3）RNA的糖基化方式（4）glycoRNA在细胞中的分布以及（5）glycoRNA的功能？
图1. 多糖报告分子Ac4ManNAz并入哺乳细胞RNA
首先进行RNA部分的分析，假定glycoRNA可能是poly-A，但是无法通过poly-A的富集方法从提取的RNA中获得glycoRNA，如图2A所示，进而用一种长度依赖的RNA分离方法，分离出小转录文本（<200 nts）和大转录文本（>200 nts），而glycoRNA却存在于小转录RNA文本中。为了进一步验证这样的观测结果，用蔗糖梯度从总RNA中的分离出Ac4ManNAz标记的RNA，通过SYBR Gold进行核酸染色分析得出主要的RNA为小RNA/tRNA，18S rRNA，和28S rRNA（如图2C所示）。在琼脂糖凝胶电泳中，glycoRNA与小RNAs的分离，显示了大分子量，但是这可能是由于多糖引起的假象。为了鉴定glycoRNA中的RNA转录文本，通过蔗糖梯度分离小RNAs和glycoRNA，进行RNA测序发现即使不同的细胞中也显现了高度的一致性，大部分的reads定位于小的、非poly-A的RNA。对H9和HeLa细胞的测序结果进行富集分析发现一组Y RNA，snRNA，snoRNA和tRNAs显示高富集度，并且得出193个RNA转录文本作为可能的glycoRNA。这些糖基化修饰的RNA有许多确定的功能作用，最为典型的是Y RNAs，因为他们的结合蛋白和核糖核蛋白是自身免疫性疾病相关的抗体，如系统性红斑狼疮。为了验证测序结果，通过CRISPR/Cas9基因敲除Y5获得293T基因敲除（KO）细胞系，来验证Y5为glycoRNA的组成部分，然后与野生型（WT）细胞进行比较发现，Y5 KO细胞中glycoRNA信号下降30%，这与测序结果显示的Y5为高富集度组分的结果相一致。至此glycoRNA的信息基本清楚。
图2. 小的非编码RNA组成了细胞glycoRNA库
对于glycoRNA的多糖，已知Ac4ManNAz转化为CMP-唾液酸添加到聚糖的末端，为了排除Ac4ManNAz在未知的代谢途径，这里采用9-azido唾液酸进行细胞孵育，发现glycoRNA随着时间增加而增加（如图3A所示）。用霍乱弧菌唾液酸酶（VC-Sia）处理Ac4ManNAz标记的细胞RNA后，发现无法显现生物素信号，对于RNA没有产生影响，而将霍乱弧菌唾液酸酶（VC-Sia）热灭活后处理Ac4ManNAz标记的细胞RNA后，显示出明显的生物素信号。接着，用抑制糖转化为唾液酸的P-3FAX-Neu5Ac发现glycoRNA信号减少，且条带上移，这是由于唾液酸的减少导致glycoRNA的负电荷减。动物体中常见的两种唾液酸形式是Neu5Ac和Neu5Gc，为了证明glycoRNA上的多糖有唾液酸组分，利用荧光探针1,2-二氨基-4,5-亚甲基二氧苯(DMB)用于衍生化游离唾液酸，通过高效液相色谱法(HPLC)进行检测和定量分析。当样品经过VC-Sia或者RNase预处理后，原本glycoRNA上存在的DMB信号消失，这样的结果进一步证明了glycoRNA的多糖存在唾液酸修饰过程（如图3D所示）。
图3. 修饰RNA的唾液酸多糖
蛋白质的糖基化存在两种连接方式：N-聚糖和O-聚糖，那么glycoRNA中的RNA和多糖是何种连接方式？为了确定连接方式，采用缺乏将Glc/GlcNAc转化为Gal/GalNAc能力的IdID突变的CHO细胞系，向细胞中加入Ac4ManNAz后，凝胶电泳很少显现glycoRNA，当向其中添加Gal，则显现了glycoRNA的条带，在同时加入GalNAc，则进一步提高glycoRNA的标记强度。为了进一步证明glycoRNA中的N-聚糖连接方式，测试了一种寡糖转移酶（OST，介导蛋白质的N-糖基化）抑制剂NGI-1，发现glycoRNA的标记强度的在随着NGI-1的加入逐渐消失，成剂量依赖关系（如图4B所示）。这说明了OST参与了glycoRNA的N-糖基化过程。使用α-甘露糖苷酶I、II的N-糖基化抑制剂，同样发现glycoRNA的标记强度的在随着剂量的增加逐渐消失，成剂量依赖关系（如图4C所示）。用一组内糖苷酶对纯化的RNA进行处理，发现其中PNGase F处理后的RNA中，Ac4ManNAz的标记信号大幅度减少，这是因为PNGase F可以用于切断蛋白质N-聚糖的天冬酰胺与多糖的酰胺键。至此，glycoRNA的N-糖基化连接方式已经得到充分证明，对于糖分子的种类，则通过PNGase F处理富集纯化的小RNA，然后对释放的多糖分子通过PGC-LC-MS的方法进行分析，获得多糖分子信息库。为了与修饰蛋白质的多糖进行差异性分析，对糖蛋白进行类似的处理，获取细胞蛋白的多糖分子信息库。在分析中发现了107种独特的多糖，通过聚类差异性分析和主成分分析，如图4F和图4G所示，发现糖蛋白的多糖和glycoRNA的多糖存在明显的差异性，且glycoRNA的多糖分子量相对较小。与此同时，在293T、H9和HeLa细胞这三种样本中发现，293T细胞和H9细胞中RNA的糖基化比例更高；HeLa细胞中，相比于糖蛋白，glycoRNA存在更高的唾液酸修饰，如图4H所示。
图4. glycolRNA的N-糖基化
获得glycoRNA的分子组成信息后，glycoRNA在细胞中的空间分布成为了必须解决问题，这与glycoRNA的功能和作用息息相关。为此，采取两种分析策略，第一种策略是将细胞核和细胞膜、细胞质区分开，然后对标记进行分析，发现glycoRNA位于细胞膜、细胞质中；然后细胞膜和细胞质进行区分开，然后对标记进行分析，发现glycoRNA位于细胞膜组分。为了研究出glycoRNA位于细胞膜外侧还是细胞膜内测的膜结构上，向活细胞中加入VC-Sia，发现glycoRNA的标记信息大幅度消失，从侧面证明了glycoRNA位于细胞膜外侧。为了充分证明glycoRNA在细胞膜外侧，采用过氧化物酶催化近距离标记策略，利用生物素-凝集素作用细胞表面多糖，然后生物素结合链霉亲和素-HRP，加入苯胺修饰的生物素，通过HRP作用后对邻近的RNA进行标记（如图5E所示），接下来检测细胞的RNA，发现MAAII或者WGA染色的产生了高分子量的条带，而ConA的却没有，如图F所示。在细胞裂解液中进行实验，发现MAAII和WGA仍然标记了glycoRNA，然而三种凝集素的rRNA的条带都很弱，但标记一致（如图5G所示）。
图5. glycoRNA位于活细胞膜外表面
位于细胞膜外侧的glycoRNA是否存在分子间相互作用，或者这是否是个新颖的独特靶点。依据测序的结果，glycoRNA可能存在双链结构，J2抗体作为一种能够靶向双链RNA的抗体，是否能够和glycoRNA结合，如果结合则可同时说明glycoRNA存在双链结构。为此，对HeLa细胞开展J2抗体的细胞流式实验，如图6B所示，J2可以靶向细胞，占比为20%。而当RNA酶破坏细胞表面glycoRNA时，J2的阳性率降低为7%，若预先用RNA酶抑制剂预处理，则J2的阳性率显示为17%。接下来研究加入NGI-1处理的话，是否会影响J2的结合率，从细胞流式结果发现J2的结合率受到NGI-1的影响，且成剂量依赖性。说明细胞表面RNA被J2抗体识别是依赖于细胞表面的N-糖基化。对于唾液酸修饰的多糖是否可以以结合唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素型受体家族（Siglec）？通过流式证明glycoRNA可以是Siglec配体的受体。
图6. 细胞表面glycoRNA有助于结合选定的Siglec蛋白
该研究打破了多糖和RNA生活在两个不同世界的传统认知，发现了既不罕见也不隐蔽的glycoRNA，这将引领一个新的研究领域，而该文章就是奠基之作。glycoRNA的功能尚不清楚，但未来可期。
Ryan A. Flynn, Kayvon Pedram, Stacy A. Malaker, Pedro J. Batista, Benjamin A. H. Smith, Alex G. Johnson, Benson M. George, Karim Majzoub, Peter W. Villalta, Jan E. Carette, and Carolyn R. Bertozzi. Small RNAs are modified with N-glycans and displayed on the surface of living cells. Cell, DOI: 10.1016/j.cell.2021.04.023.
