SCIENCE丨多受体介导的转录调控用于T细胞的精确识别
作者：汪俊彦
大家好，今天和大家分享一篇近期发表在Science上的文章《Precise T cell recognition programs designed by transcriptionally linking multiple receptors》，通讯作者是加州大学旧金山分校细胞及分子药理系的Wendell A. Lim教授。Wendell A. Lim教授实验室主要研究细胞内由基因编码控制的信号网络，并使用合成生物学方法来构建或重组这些网络，同时设计具有新功能的细胞用于识别和治疗疾病。
Notch通路是细胞内非常简单的一种信号转导机制：呈递在靶细胞表面的Delta家族蛋白配体与Notch受体相互作用后，会由崩解素、金属蛋白酶、金属蛋白酶-分泌酶复合物依次水解Notch受体，从而释放出转录激活因子，激活在细胞间信号传导中起关键作用的基因。Notch通路中的受体结构域、转录因子结构域以及下游的靶基因都可以被替换，构建出synNotch，从而实现对细胞内信号的调节。而具有不同胞内和胞外区结构域的synNotch的功能是相互正交的，因此，可以在同一个细胞中同时部署多个synNotch通路，实现复杂的组合传感电路，用于构建治疗细胞。
图 1. Notch受体及SynNotch受体的结构。
作者认为，对靶细胞的精确识别是治疗肿瘤等疾病的核心问题。在目前的治疗体系中，主要是依靠抗体、双特异性抗体或嵌合抗原受体 (CARs) 等，与单一的癌细胞表面相关抗原相互作用，来识别恶性细胞。然而，我们很难只通过一种抗原将大多数肿瘤细胞与健康细胞区分开来。并且，正常细胞间的精确识别，往往也是通过多个受体信号的整合来实现的。因此，我们需要设计组合传感电路，利用疾病细胞的多个分子特征，实现靶细胞的精确识别。在这篇文章中，作者共设计了四种不同的传感电路。
第一种，双输入“与”门。CD8分子是部分T细胞表面的一种白细胞分化抗原糖蛋白，辅助T细胞受体 (TCR) 识别抗原并参与T细胞活化信号的转导，表达CD8的T细胞 (CD8+ T细胞) 通常在活化后分化为细胞毒性T细胞，能够特异性地杀伤靶细胞。作者在CD8+的T细胞内构建了一个简单有效的传感电路，能够整合细胞外和细胞内的输入信号，特异性识别并杀伤黑色素瘤细胞 (图2 B)。如图2 C所示，黑色素瘤细胞内的抗原MART1，会通过主要组织相容性复合物，呈递在细胞表面，因此，常规的抗MART1的T细胞疗法，具有一定的抗肿瘤作用。然而，正常的黑色素细胞也会表达MART1，所以，抗MART1的T细胞也会引起严重的皮疹、白癜风、葡萄膜炎和听力损失等副作用。为了解决这类问题，作者在CD8+ T细胞内构建了一个anti-MET Gal4-VP64 synNotch → anti-MART1 TCR传感电路，黑色素瘤细胞膜表面高表达的肝细胞受体生长因子 (MET) 能够识别T细胞膜表面的synNotch受体，从而激活T细胞膜受体蛋白人白细胞抗原A2 (HLA-A2) 的表达，HLA-A2则能够识别呈递在黑色素瘤细胞膜表面的细胞内抗原MART1，从而促使T细胞的大量复制，杀伤黑色素瘤细胞。相较于持续表达anti-MART1 TCR的T细胞，表达anti-MET Gal4-VP64 synNotch → anti-MART1 TCR传感电路的T细胞，在高效杀伤黑色素瘤细胞的同时，不会产生大量的细胞因子，对正常的黑色素细胞也不会产生杀伤作用 (图 2 D, E)。
图 2. 多输入细胞间信号传感电路。
第二种，“非”门的构建。近期的生物信息学研究表明，正常细胞中表达而靶癌细胞中不表达的抗原，能够有效抑制细胞治疗中因交叉反应而产生的副作用。所以，作者又构建了一个新的传感电路，包含anti-GFP LEXA-VP64 synNotch → anti-CD19 TCR的“与”门及anti-HER2 GAL4-VP64 synNotch的“非”门 (图 3 A)。其中，“与”门的构建方式与前面所述相同。而anti-HER2 GAL4-VP64 synNotch的“非”门，是将synNotch通路激活的基因变成了促凋亡蛋白tBID，当靶细胞表面有HER2蛋白时，就能通过anti-HER2 GAL4-VP64 synNotch通路，激活tBID的表达，从而促使CD8+ T细胞凋亡 (图 3 B)。这里值得注意的是，anti-HER2 GAL4-VP64 synNotch的“非”门和anti-GFP LEXA-VP64 synNotch → anti-CD19 TCR的“与”门连用时有很好的效果，而和持续性的单独的anti-CD19 TCR连用时就没有很好的效果，作者将这个现象归结于不同信号通路之间的时间差。
图 3. 同时包含与“门”和“非”门的信号传感电路构建。
第三种，三输入“与”门。作者通过两种不同的方式构建了，整合EGFR GAL4-VP64 synNotch 1、MET LEXA-VP64 synNotch 2及HER2 CAR三种输入的“与”门传感电路。一种是串联式：即synNotch 1通路激活synNotch 2通路蛋白的表达，再由synNotch 2通路激活CAR通路蛋白的表达，形成串联“与”门传感电路；另一种是并联式：即synNotch 1通路激活CAR通路第1部分的表达，而synNotch 2通路激活CAR通路第2部分的表达，形成并联“与”门传感电路 (图 4 A, B)。经研究发现，串联式三输入传感电路能完美的激活T细胞增殖，并且杀死同时表达EGFR、MET和HER2三种抗原的肿瘤细胞 (图4 C - E)。而并联式三输入传感电路则会产生信号泄露，不仅能够杀死同时表达EGFR、MET和HER2三种抗原的肿瘤细胞，还对只表达EGFR和HER2的肿瘤细胞有杀伤作用。作者认为，并联式的信号泄露可能是anti-MET synNotch通路的表达泄漏造成的，而在串联式中，这种泄露会以乘法的形式规避。基于体外实验的优良结果，作者将表达MET和HER2，以及表达MET、EGFR和HER2的K562肿瘤细胞，同时植入了免疫缺陷型小鼠的两侧，然后将并联式三输入“与”门T细胞尾静脉注射到小鼠中 (图 4 F)。结果表明，T细胞能够精确识别并快速清除三抗原肿瘤，而对双抗原肿瘤则没有效果 (图 4 F)。
图 4. 高特异性三输入“与”门传感电路的构建及体内验证。
第四种，“或”门的构建。虽然对疾病细胞的高特异性识别非常重要，但疾病细胞固有的异质性及部分抗原的丢失，需要我们提高识别的灵活性，所以作者又通过synNotch构建了两种“或”门传感电路：anti-MET synNotch → anti-EGFR/anti-HER2 CAR及anti-EGFR/anti-HER2 synNotch → anti-MET CAR (图 5 A)。分别表达这两种“或”门传感电路的T细胞都能够精确识别并快速杀死对应的肿瘤细胞 (图 5 B，C)。
图 5. 或“与”门传感电路的构建及本文总结。
最后，作者总结了在本篇文章中构建的四种传感电路并表明：通过细胞工程技术，能够整合多个分子识别事件，实现更精确快速的目标细胞识别 (图 5 D，E)。
