JACS | 化学酶法增强DNAzyme催化活性
今天给大家分享的是一篇发表在JACS上的文章，题目为Chemoenzymatic Installation of Site-Specific Chemical Groups on DNA Enhances the Catalytic Activity.
通讯作者：
于涵洋，南京大学现代工程与应用科学学院教授，研究方向主要以人工核酸为开展化学生物学和合成生物学方面的研究工作。
梁勇，南京大学化学化工学院教授，研究方向主要是通过计算和实验相结合的方法，研究有机化学反应的机理。
研究背景：
天然的生物催化剂包括蛋白质酶和RNA酶，而只使用DNA来存储遗传信息。尽管如此，RNA和DNA之间的化学相似性自然导致了DNA作为催化剂的探索检验，特别是因为DNA比RNA更稳定，成本更低，更容易合成。目前已经发现，单链DNA可以折叠成稳定的三级结构，具有结合亲和力和催化活性。这些功能性DNA分子，包括适配体和催化剂已成为化学生物学和分子医学等各个研究领域的宝贵工具。
然而，与蛋白质对应物相比，功能性DNA通常表现出较差的性能。当前研究一般是探索了几种通过化学修饰来改善 DNA 功能的策略，比如说将蛋白质样官能团引入核碱基，或者广泛的化学改性。然而，这些修饰策略通常需要复杂制备化学修饰的单体构建单元，然后进行酶介导的聚合或固相寡核苷酸合成。因此，需要开发一种更简单、更易获得的位点特异性DNA修饰方法，以提高DNA催化剂的性能。
结果与讨论
1.化学酶法引入多种氧胺化合物修饰DNAzyme
Figure 1. Site-specific introduction of various chemical functionalities
to DNA.
作者设计了化学酶法修饰DNAzyme的新策略，首先通过固相合成含有非经典碱基序列的DNAzyme变体，然后通过特异性糖苷酶切除非经典碱基，形成 AP 位点。最后采用一系列化合物选择性反应，促进了不同化学官能团在特定位置的掺入，之所以选择这几种官能团，是因为它们的功能基团类似于蛋白氨基酸的侧链。
2. 特定位点的化学修饰提升DNAzyme的催化活性
Figure 2. Modifications on positions 8 and 12 enhance deoxyribozyme 10−23 activity.
通过分析研究不同位点上的官能团修饰对催化活性的影响，虽然在其他十个位点上的化学修饰完全消除了催化活性，但无论引入的官能团的性质如何，在两个位点（T8和A12）引入选定的官能团显着增强了脱氧核酶活性。结果表明，在8号位引入羧基（T8Ca）、在12号位引入苯环（A12Bn）有效提升了DNAzyme的催化活性。
3. 双位点的化学修饰进一步提升DNAzyme的活性
Figure 3. Two concomitant modifications markedly improve the deoxyribozyme 10−23 catalytic activity.
作者通过组合使用两种非典型碱基-糖苷酶对，在一个DNA酶分子的8和12号位分别引入羧基和苯环，该双修饰DNAzyme（CaBn）的催化活性比野生型提升了近700倍，并发现DNAzyme修饰过程存在AP位点时易被化学裂解。
4. 化学修饰的DNAzyme的催化稳定性
Figure 4. The oxime in CaBn deoxyribozyme was stable over a large pH range.
通过质谱分析，凝胶电泳可以看出CaBn在较大的pH范围内保持稳定，同时其在反应过程中也保持稳定。孵育1小时后仍能保持完整，催化活性基本与野生型相同。
5. 化学修饰的DNAzyme可提高在各种底物上的活性
Figure 5. Activity analysis of dually modified 10−23 with various
为了探索催化活性增强是否适用于其他底物，作者检查了另外三种底物的反应动力学曲线。与WT相比，所有单修饰和双修饰的脱氧核酶变体都表现出更好的催化活性。
6.基于CaBn修饰的DNAzyme的生物传感器
Figure 6. CaBn-based Mg2+ sensor.
考虑到催化活性和对Mg2+的敏感性，作者将CaBn转化为Mg2+的特异性荧光传感器，相比于传统的DNA酶传感器，CaBn修饰的DNAzyme传感器展现出更高的Mg2+敏感性。
7.化学修饰的DNAzyme的催化机理研究
Figure 7. Catalytic mechanism of deoxyribozymes.
为了获得对特定化学修饰所赋予的催化活性改进的机制见解，作者对在过渡状态下进行了分子动力学模拟。利用核磁衍生结构作为起点，构建了底物复合物的初始结构。结果可以看出，引入CaBn修饰后，金属离子结合位点2的镁离子分布概率增加，并且和RNA切割位点的距离变近，因此CaBn具有更强的镁离子招募能力，比野生型更容易折叠形成活性的催化构象。
8.化学酶法提升其他DNAzyme的催化活性
Figure 8. Two additional examples of chemically modified deoxyribozymes with
enhanced catalytic activities.
验证化学酶法的策略是否可以用来增强其他脱氧核酶的催化活性，通过选择了另外两种脱氧核酶，分别是具有RNA连接酶活性的9DB1，具有RNA切割活性8-17。经过位点特异性修饰和活性筛选，均显示出比野生型更高的催化活性，结果表明化学酶法是提高脱氧核酶催化活性的通用方法。
总结：
总之，该工作开发了在DNA上特异性位点引入化学修饰的新方法，利用非经典核碱基、特异性糖基化酶和氧胺化合物，合成并鉴定了具有更高催化活性的DNAzyme，该方法的广泛适用性也会带来更多可能。
Ze Zhang, Wanqing Wei, Siqi Chen, Jintao Yang, Dongfan Song, Yinghan Chen, Zerun Zhao, Jiawen Chen, Fulong Wang, Jiahuan Wang, Zhe Li, Yong Liang, and Hanyang Yu
Journal of the American Chemical Society 2024 146 (10), 7052-7062
DOI: 10.1021/jacs.4c00484
